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番茄內(nèi)標準Apx基因探針法qPCR試劑盒實驗操作步驟

瀏覽次數(shù):305發(fā)布日期:2025-07-25

番茄內(nèi)標準Apx基因探針法qPCR試劑盒實驗操作步驟

在完成反應(yīng)體系配制后,將PCR管或96孔板短暫離心,確保液體集中于管底,避免氣泡干擾。隨后將反應(yīng)板置于qPCR儀中,按照以下程序設(shè)置擴增條件:

1. 預(yù)變性階段:95℃維持30秒,充分激活DNA聚合酶并打開模板二級結(jié)構(gòu);

2. 循環(huán)擴增階段:95℃變性5秒,60℃退火/延伸30秒(根據(jù)引物Tm值可微調(diào)),重復(fù)40個循環(huán);

3. 熔解曲線分析(可選):從60℃緩慢升溫至95℃,每0.5℃采集一次熒光信號,驗證擴增特異性。

實驗過程中需注意:

- 陰性對照:設(shè)置無模板對照(NTC)以排除污染風(fēng)險;

- 重復(fù)孔:每個樣本至少設(shè)3個技術(shù)重復(fù),確保數(shù)據(jù)可靠性;

- 熒光通道選擇:若使用探針法,需匹配儀器FAM/HEX等通道,避免信號串擾。

數(shù)據(jù)分析時,采用ΔΔCt法計算目標基因相對表達量。首先用內(nèi)參基因(如Actin)Ct值校正樣本間差異,再通過實驗組與對照組的Ct差值比較獲得表達倍數(shù)變化。若熔解曲線出現(xiàn)多峰或陰性對照出現(xiàn)擴增,需排查引物二聚體或污染問題。

為提高實驗成功率,建議在正式實驗前進行預(yù)實驗優(yōu)化退火溫度及引物濃度。此外,試劑盒開封后需分裝保存,避免反復(fù)凍融影響酶活性。通過嚴謹?shù)牟僮髁鞒毯唾|(zhì)控步驟,可確保番茄Apx基因表達分析的準確性和重復(fù)性。


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